肌萎缩侧索硬化（ALS）又名“渐冻症”。年，美国波士顿学院前棒球选手发起的“ALS冰桶挑战赛”使这一罕见疾病逐渐被大众认知。由于ALS目前还无法治愈，亟需通过体外模型对其发病机制进行深入研究。最近在JournalofNeurochemistry杂志中发表的一篇文章提到，微流控技术在体外神经肌肉接头（NMJ）模型的建立中发挥了重要作用，不仅促进了疾病机制的深入研究，还推动了相关研究领域的进一步发展。
本文承接：微流控技术在肌萎缩侧索硬化（ALS）疾病模型中的应用和发展(上）
5.ALS芯片的发展与应用
越来越多的证据表明，ALS之类的神经肌肉疾病是一种远端轴突病变，在有临床症状之前就已出现明显的NMJ功能障碍。为了更好地了解NMJ在ALS中扮演的角色，通常使用NMJ芯片加以研究。
5.1NMJ的研究方法
在体外实验中，可以通过形态读出对NMJ加以研究（表1）。例如，通过延时显微镜观察神经突起的生长、神经元与肌肉的联系以及肌纤维的分化；利用免疫细胞化学技术对AChR进行观察等。
NMJ第二种研究方法为“功能分析”。功能性NMJ可以促进运动神经元和骨骼肌之间的通讯，通过对运动神经元的刺激来测量肌细胞的反应。对NMJ的功能评估非常重要，因为形态读出可能无法反映NMJ实际功能的好坏，我们在表1中列举了评估NMJ功能的各种方法。
表1微流控平台中NMJ的形态和功能分析
5.2如何使用微流控平台研究ALS中的轴突变性？
在ALS中，轴突变性一般发生在神经元胞体丢失之前，其具体机制尚不明确（图3a）。轴突运输是轴突的一项重要生理过程，是确保蛋白质、脂质和细胞器（如线粒体）从胞体向NMJ运输的关键，轴突运输还能清除轴突中回收和错误折叠的蛋白质，从而防止有*聚集体的形成。轴突变性后，其运输功能将受到重大影响。研究发现，当轴突受损时，线粒体的顺向运输会受到影响，导致线粒体在细胞体内积聚，从而使运动神经末梢的线粒体密度降低，同时线粒体的功能也会受到影响。
为了研究轴突的输运过程，我们需要在体外建立相关模型。但在常规共培养模型中，轴突向肌细胞生长的方向是随机的，非常不利于轴突运输过程的研究。而在微流控装置中，连接的微通道明确了传输方向（图3b），利用透明的微槽和信号分子梯度，引导轴突从近端到远端定向生长，为研究轴突运输过程创造了有利条件。
远端轴突是一个重要的亚细胞结构，它包含局部翻译机制，这对于内部和外部触发器的信号响应非常重要。为了研究轴突的转录过程，分离无体细胞污染的轴突RNA显得尤为重要。有研究报道，使用Xona微流控装置能够在不污染非轴突物质的情况下分离轴突RNA。另外一项研究报道了一种轴突测序方法（图3b）。这项技术结合了微流控技术、空间单细胞RNA测序和生物信息学分析，能去除含有细胞交叉污染的样品，它可以用来阐明ALS的疾病机制，有非常好的应用前景。它还可以通过三室微流控装置来研究轴突近端和远端之间的差异。这种方法可以在完整的细胞中同时观察数千个mRNA，并保留每个转录本的空间信息。这种方法还可以对比近端和远端轴突室之间的差异。
图3在微流控装置中研究ALS的发病机制
5.3ALS中的非细胞自主过程
研究发现，运动神经元以外的其他类型细胞也参与了ALS的发病机制（图3a），利用微流控装置可以很好地研究细胞之间如何相互作用以及如何对运动神经元造成影响。例如，把有前驱症状的SOD1G93A小鼠原代心肌细胞和小鼠胚胎脊髓外植体共培养后发现，与SOD1wt细胞相比，轴突很少穿过微管到达SOD1G93A心肌细胞。这表明ALS中的心肌细胞可能会对轴突造成影响。
神经胶质细胞在ALS发病机制中的作用也已被证实。研究发现，把小鼠ESC衍生运动神经元与小鼠ESC衍生ALS突变的星形胶质细胞纳入微流控装置中共同培养后，SOD1G93A星形胶质细胞会显著减少运动神经元的突触数量，并导致肌肉收缩减弱。这两个发现都类似于ALS在体内的早期外周病理学改变的关键特征，强调了在微流控NMJ模型中加入胶质细胞的必要性。
5.4ALS芯片在药物研发中的应用
由于患者的异质性和其他因素，ALS的药物研发困难重重。但把微流控技术和iPSC技术相结合，利用微流控装置的高通量性来筛选适合病人的药物，将有助于为患者提供药物的精确研发。
在药物筛选方面，微流控NMJ培养模型的一个创新之处在于加入（iPSC衍生的）内皮细胞（EC）。众所周知，由于人体血脑屏障和血脊髓屏障的存在，药物很难穿过内皮屏障到达相关组织。因此，为了模拟体内环境，我们需要在体外建立一个人工内皮屏障用以筛选合适的药物。在最近的一项研究中，将iPSC衍生的EC接种在胶原凝胶层上形成单层EC，然后与iPSC衍生的ALS神经球共培养，建立起一个有EC屏障的三维ALS芯片模型，用以测试最近进入ALS临床试验的两种药物：bosutinib和rapamycin。研究发现，bosutinib和rapamycin联合治疗能改变药物的血管通透性，恢复肌力，防止ALS运动单位死亡。这些结果足以证明EC屏障在体外NMJ模型中的重要性。
6.展望
微流控技术在体外NMJ模型中的应用非常广泛。由于NMJ病理过程受运动神经元、骨骼肌和其他类型细胞的共同影响，因此可以在模型中加入胶质细胞来进一步研究NMJ疾病模型的生理特性。未来还可以在NMJ模型中加入血管系统，用以改善各种神经肌肉疾病的药物筛选过程，并同时促进体芯片技术的发展。各种器官还可以在微流控平台上共同培养，通过脉管系统相互连接，用以研究新型疗法的药代动力学过程。另外，由于骨骼肌在ALS发病机制中起着重要作用，通过肌肉用药可能会有较好的疗效。NMJ模型的另一个发展方向是NMJ类器官的建立和应用，但在广泛应用之前还需要进一步验证。衰老是导致ALS的一个重要因素，但iPSC衍生的神经元已经失去了大部分与衰老和环境风险相关的表观遗传记忆，因此还需进一步研究诱导iPSC培养中细胞衰老和应激的各种方法。
7.结语
微流控技术与iPSC技术的结合为NMJ病理学研究开辟了新的途径。由于微流控装置为疾病的研究提供了高度可控的环境，因此可用于新型药物的筛选，这将大大简化药物开发过程。
参考文献deJonghR,SpijkersXM,Pasteuning-VuhmanS,etal.Neuromuscularjunction-on-a-chip:ALSdiseasemodelingandread-outdevelopmentinmicrofluidicdevices[J].JNeurochem,.
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